Una carrera contrareloj por la investigación en el Síndrome de Opitz C.

Por la Dra. Roser Urreizti Frexedas. Investigadora Postdoctoral del Departamento de Genética de la Facultad de Biología (UB) y del CIBERER.

En el grupo de Genética Molecular Humana de la UB participamos, junto con la Asociación Opitz C, en un Crowdfunding para lograr los fondos necesarios para continuar las investigaciones sobre este devastador síndrome. Una enfermedad tan rara que carece prácticamente por completo, de soporte por parte de los organismos públicos y de las farmacéuticas, carentes de interés en una patología con pocos pacientes.

Por ello os animamos a realizar un donativo, por pequeño que sea, en la plataforma Precipita (Aquí)

 

¿Qué es el Síndrome de Opitz C (OCS)?

Características clínicas

El Síndrome de Opitz C (o Opitz-trigonocefalia) fue descrito por
primera vez en 1969 por el Dr. John M. Opitz[1]. Es una enfermedad rara, severa y heterogénea, de la que se han descrito unos 60 casos [2].

Las afectaciones patológicas de este síndrome afectan a todos los sistemas y son muy variables entre pacientes [3]. Los rasgos más característicos son el retraso psicomotor (de severidad variable) y la trigonocefalia (por la fusión prematura de la sutura metópica). Es importante tener en cuenta que pese a que a menudo a este síndrome se lo mal-denomina “trigonocefalia”, esta es una característica clínica presente de forma primaria o secundaria en numerosos síndromes y no es, en ningún momento, suficiente para diagnosticar este síndrome. Es también característico la aparición de dismorfismos faciales (retrognatia, fisuras palpebrales  inclinadas, pliegues epicantales…). También aparecen malformaciones como el acortamiento del cuello, las contracturas en las articulaciones y criptorquidia en niños y clítoris prominente en niñas, así como anomalías internas (malformaciones cardíacas congénitas y afectación pancreática y renal). Es también frecuente entre estos pacientes sufrir hipotonía y ataques de epilepsia [2, 4-6].

Dada su severidad, este síndrome presenta una elevada mortalidad, y el 50% de los pacientes morirá durante el primer año de vida [6].

Frecuencia:

El síndrome de Opitz C es una enfermedad conocida como ultra-rara. Se ha estimado una prevalencia para esta patología de 1/800.000 a 1/1.000.000 nacidos vivos. De hecho, la elevada mortalidad de este síndrome y la dificultad para diagnosticarlo correctamente han llevado a diversos especialistas a sugerir que puede tratarse de un síndrome más común, más frecuente entre fetos y niños mortinatos no diagnosticados [6].

Similitudes con el Síndrome de Bohring-Opitz (BOS)

El síndrome de Opitz C presenta solapamiento clínico con el Síndrome de Bohring-Opitz o Síndrome C-like (BOS), un desorden con afectaciones aún más severas que el de Opitz C. Estos pacientes suelen sufrir retraso de crecimiento intrauterino, un mayor retraso psicomotor, mayor prevalencia de los ataques de epilepsia, hipotonía muy severa e incapacidad para deglutir. Al igual que los pacientes de Opitz C, éstos presentan trigonocefalia, contracturas de las articulaciones y dismorfismos faciales, así como afectación de varios órganos internos como el corazón o los riñones [7].

El hecho de que algunos pacientes presenten características de uno u otro síndrome ha llevado a los expertos a plantearse la posibilidad de que, en realidad, se trate de un único síndrome con un espectro de severidad variable, desde la forma OTC menos severa a la BOS, más grave [7].

¿Cómo se hereda este Síndrome?

Hasta la fecha se desconoce tanto el gen o genes responsables de este síndrome como su modo de herencia. Muchos casos son esporádicos por lo que este síndrome podría tener un patrón de herencia Autosómica Dominante. Al tratarse de una patología tan grave, eso implica que las mutaciones que lo causan sean “de novo”, es decir, nuevas, no heredadas de los padres (ya que estos son sanos).

Por el contrario, el número relativamente elevado de casos en que más de un hijo sufre la enfermedad, un ratio de afectación igual entre ambos sexos (no afecta más frecuentemente a niños que a niñas o viceversa) y la presencia de consanguinidad asociada a este síndrome sugiere también que podría tener un patrón de herencia Autosómico Recesivo. Si bien tampoco puede descartarse que existan casos con herencia ligada al cromosoma X.

El propio Dr. Opitz postuló en 2006 que en realidad podrían estar coexistiendo ambas formas de herencia [6].

¿Cuál es la base molecular de este Síndrome?

Si ni siquiera el patrón de herencia está claro, mucho menos el gen o genes causantes. Y dado que parece que ambas formas de herencia podrían coexistir, es muy posible que estemos frente a una patología con heterogeneidad genética, en la que un cuadro clínico puede deberse a mutaciones en distintos genes.

En el caso del Síndrome de Bohring-Opitz (BOS) se ha visto que la mitad de los pacientes presentan mutaciones de novo en el gen ASXL1 [8], también conocido por su implicación en leucemia. Aun así, queda otra mitad de pacientes en los que el origen de la enfermedad es desconocido, lo que sugiere que en este caso hay también heterogeneidad genética.

En el año 2007, T. Kaname y colaboradores [7] encontraron una translocación balanceada en un paciente con OCS que provocaba la disrupción del gen CD96. Tras analizar este gen en el resto de pacientes de los que disponían, afectados tanto de OCS como de BOS, encontraron una mutación puntual, de novo, en un paciente BOS, el cambio a nivel proteico T280M (la Treonina en posición 280 de la proteína está mutada a Metionina). Pero no encontraron ninguna otra mutación en este gen en ninguno de los restantes 26 pacientes. Estos autores propusieron el gen CD96 como responsable de al menos una pequeña parte de los casos de Opitz C, siendo el único gen asociado a este síndrome hasta la fecha.

La implicación del gen CD96 en estos síndromes ha sido puesta en entredicho por la contribución del Dr. Darlow en el reciente European Human Genetics Conference (París, 2013)[9]. Estos autores encontraron el gen CD96 truncado en pacientes con problemas renales pero sin ninguna otra característica  clínica del síndrome de Opitz C.

Hay que hacer notar que diversos laboratorios ofrecen pruebas diagnósticas moleculares para el síndrome de Opitz C, consistentes, exclusivamente, en analizar la presencia o ausencia de la mutación p.T280M. Ya que este cambio se encontró en un único paciente, esta prueba tiene una utilidad prácticamente nula y supone un gasto más para la ya gravada familia.

La identificación del gen responsable de una enfermedad es el primer paso para el mejor entendimiento de su patofisiología lo que a su vez supone el punto de partida en el desarrollo de dianas terapéuticas.

¿Cómo se inició este proyecto?

El proyecto se inició en 2011 tras el contacto entre Carles (presidente de la Asociación de Pacientes de Opitz C y padre Marta, una paciente) y nuestro grupo de Genética Molecular Humana de la Universitat de Barcelona (liderado por los Drs. Grinberg y Balcells). La historia de Carles y su familia y lo devastador de este síndrome nos conmovió y decidimos asumir el reto de buscar el gen o genes responsables de este síndrome.

En este inicio se estableció una estrecha colaboración con el Dr. Giovanni Neri, que había estado llevando a cabo un estudio sobre esta enfermedad y facilitó la mayoría de las muestras de los pacientes y sus familiares, y el propio Dr. John M. Opitz, quien ha revisado el diagnostico de los pacientes.

Esta colaboración y el contacto directo de Carles con las familias nos permito reunir un grupo de 12 pacientes y sus familiares, mayoritariamente diagnosticados como OCS, si bien uno de los pacientes fue diagnosticado como BOS y un pequeño grupo quedó con “diagnostico tentativo”.

¿Que se ha hecho ya?

Entre los años 2007 y 2009, el grupo liderado por el Dr. Giovanni Neri (Universita Cattolica del Sacro Cuore, Roma, Italia) realizó un estudio de MicroArray –CGH. En este estudio participaron 7 pacientes diagnosticados como Opitz C. En uno de los pacientes se caracterizó una gran deleción, lo que llevó al equipo investigador a excluirlo del grupo de pacientes Opitz C. En el resto de pacientes no se encontró ninguna modificación genómica significativa. El MicroArray-CGH permite detectar grandes reordenaciones genómicas (deleciones, translocaciones e inserciones), del mismo modo que haría un cariotipo, pero con un nivel de resolución mucho mayor. Pero es incapaz de detectar cambios sutiles: mutaciones puntuales o inserciones y deleciones pequeñas.

Como hemos dicho, en el año 2011, Carles, acudió a nuestro grupo de Genética Molecular Humana de la Universidad de Barcelona en busca de ayuda para que la investigación en este síndrome continuase su curso ya que nuestro grupo tiene una gran experiencia y tradición en el estudio de enfermedades raras. En este año se estableció una colaboración efectiva con el equipo del Dr. Neri en Roma y con el mismo Dr. Opitz en Utha, se recogieron las muestras de los 7 pacientes participantes en el estudio del Dr. Neri y sus familias y desde entonces se han reclutado 6 pacientes más (incluyendo una pareja de hermanos afectados).

Financiados principalmente por los fondos de la Asociación y de las propias familias y la colaboración del CIBERER y el CNAG y la entusiasta participación del BIER, hemos realizado la secuenciación masiva (ver más abajo) de 4 grupos familiares, incluyendo una pareja de hermanos, y de dos pacientes individuales, con su consiguiente análisis bioinformático.

En el Departamento de Genética hemos filtrado miles de cambios y analizado más de 200 posibles mutaciones mediante secuenciación tradicional. Estos análisis nos han permitido confirmar el diagnóstico de Bohring-Opitz en lugar de Opitz C, ofreciendo a su familia un diagnóstico molecular preciso, lo que abre la vía al diagnóstico prenatal. También se ha encontrado la causa genética de la patología en la pareja de hermanos, también descartándolos como Opitz C y definiendo mejor su fisiopatología. Afortunadamente existe un tratamiento posible con resultados relativamente esperanzadores para los individuos con mutaciones en el mismo gen que ellos, lo que brinda a estos chicos nuevas oportunidades de mejorar su calidad de vida, y ofrece a la familia la posibilidad de un diagnóstico prenatal en caso de desearlo.

También hemos encontrado una mutación nueva en un gen poco conocido en una de las pacientes Opitz C españolas. Desgraciadamente no hemos encontrado ningún cambio en el mismo gen en el resto de los pacientes, lo que nos obliga a emprender costosos ensayos funcionales para dilucidar si este cambio es realmente la causa de la enfermedad en la paciente (ver más abajo).

¿Y que falta por hacer?

Siguen quedando muchos cambios por validar y muchos análisis por hacer. Queremos poder realizar el estudio del exoma (ver más bajo) de restantes familias y abordar los ensayos funcionales necesarios, en especial para la mutación ya encontrada en una paciente Española.

Poder continuar dando esperanzas a estas familias  depende de la colaboración de todos. Por eso rogamos tu participación en este proyecto. Tu apoyo es fundamental para estas familias.

http://www.bit.ly/donacio

¿Quieres saber más?

¿Cómo se aborda este estudio?

Hasta la fecha, la técnica más utilizada en la búsqueda de nuevos genes ha sido el análisis deligamiento o Linkage, en que se analiza la herencia compartida ente familiares afectos y no afectos. Pero el éxito de este análisis está muy limitado a la disponibilidad de grandes familias con más de un miembro afectado, lo que no es siempre posible. En muchos casos, a la hora de abordar el estudio de una enfermedad, contamos con familias pequeñas (padre, madre, el paciente y a veces un hermano, afecto o no). Otra limitación de la técnica del análisis de ligamiento es que obtener buenos resultados es muy dependiente de conocer el patrón de herencia de la patología, cosa que en este caso ya hemos determinado que sigue siendo desconocido.

Tradicionalmente otra aproximación con buenos resultados ha sido la secuenciación de genes candidatos. Esta estrategia consiste en analizar la secuencia nucleotídica de los pacientes para un número muy limitado de genes, elegidos en base a una hipótesis clara y plausible de implicación de dichos genes en el desarrollo de la patología. Dado el gran desconocimiento que hay sobre el Síndrome de OpitzC y su afectación tan variada, esta estrategia no es razonable, más allá de analizar los genes que se han asociado ya con esta patología o similares (ASXL1, CD96 y recientemente ASXL3 [10]).

En general, estas técnicas se han usado de forma combinada ya que los ensayos de ligamiento no suelen ser suficientemente resolutivos, “señalando” regiones muy grandes, con 10-30 genes en ellas, como regiones posiblemente implicadas en la enfermedad. Una vez se selecciona una región, se analiza qué genes contiene y se secuencian aquellos que sean “mejores candidatos” por su función [11].

Pero como hemos dicho, en el caso que nos ocupa no disponemos ni de granes familias que nos permitan abordar un ensayo de ligamiento eficaz ni de un patrón bioquímico o clínico claro que nos pueda sugerir unos pocos candidatos (fuera de los tres ya mencionados). De ahí que estas técnicas hayan resultado inútiles para encontrar la base genética del Síndrome de Opitz C.

En los últimos 10 años han aparecido nuevas técnicas, conocidas como secuenciación de alto rendimiento o de siguiente generación (NGS por el inglés, Next Generation Sequencing) que han permitido abordar estos proyectos que, de otro modo, era prácticamente imposible realizar.

¿Qué son las NGS (o secuenciación de alto rendimiento)?

Mientras que la secuenciación tradicional permite visualizar pequeños fragmentos del genoma (alrededor de 1000pb), la secuenciación masiva permite secuenciar la práctica totalidad del genoma de un individuo (unas 3000Mb). Es decir, tienen cerca de un millón de veces más rendimiento. El coste por par de bases (bp) de cada una es muy distinto. Mientras que la secuenciación tradicional tiene un coste de unos 3€ por fragmento, un genoma entero cuesta entre 1000 y 3000€. Así que a nivel de precio por pb es mucho más competitiva la secuenciación del genoma, pero a nivel general, un genoma es caro. Además es importante analizar tanto al paciente como a los padres y son varios grupos de varios pacientes, lo que supone un número relativamente elevado de muestras y dispara los costes de este tipo de proyectos.

La realidad es que la mayoría de mutaciones causantes de enfermedades severas como la que nos ocupa se encuentra en una pequeña fracción del genoma, lo que conocemos como exoma. El exoma es el conjunto de los exones, aquellas regiones de cada gen que contienen la información estrictamente necesaria para realizar la función de dicho gen (en la mayoría de los casos, formar una proteína). Hay unos 180.000 exones que constituyen el 1% de la totalidad del genoma.

Actualmente existen diversas técnicas de “captura” (o enriquecimiento) que nos permiten secuenciar exclusivamente estas regiones de interés en un individuo dado, lo que se conoce como Secuenciación de Exomas (ES, por Exome Sequencing). Esta técnica cubre la mayor parte de la región informativa y reduce los costes sensiblemente (secuenciar un exoma cuesta entre 600 y 800€) [12].

Esta técnica está siendo ampliamente usada en genética humana con buenos resultados. De hecho, fue mediante esta técnica que se encontraron las mutaciones en el gen ASXL1 causantes de BOS que hemos mencionado anteriormente [8] y ha permitido encontrar genes implicados en otras enfermedades raras [12].

Esta técnica presenta una enorme ventaja frente a la secuenciación de genes candidatos o al linkage: no necesitamos tener un diagnóstico clínico claro y esta técnica es útil incluso cuando hay más de un gen implicado en la aparición de la enfermedad. Nos permite realizar un análisis personalizado, familia a familia, incluyendo aquellos casos con diagnósticos dudosos. Dado lo poco que se sabe del Síndrome de Opitz y su gran heterogeneidad clínica, la secuenciación masiva es la única herramienta existente con buenas perspectivas de éxito.

Y una vez secuenciado, ¿qué?

Dada la cantidad de nucleótidos secuenciados es lógico que un porcentaje de las mutaciones observadas sean errores producidos durante el proceso de secuenciación. La mayoría de métodos de secuenciación masiva tienen ya porcentajes de error inferiores al 1^º/_ºº [13]. Aún así, al secuenciar unas 30 Mb (es decir, 30 millones de pares de bases, un exoma) esperamos cerca de 30.000 errores por cada muestra analizada. Así, los datos generados por la secuenciación masiva deben ser primero filtrados y depurados [14]:

• En primer lugar, por parámetros de calidad de la lectura, lo que reduce drásticamente el número de errores.
• Disponemos además de bases de datos públicas (1000Genomes, EVS, entre otras) que recogen las mutaciones comunes en la población general. Estas bases de datos nos permiten eliminar aquellos cambios encontrados en los pacientes y presentes en personas sanas que, por lo tanto, no serán causantes de la enfermedad. Así, eliminaremos cerca del 90% de los cambios restantes en cada paciente.
• Finalmente, debemos filtrar en función del patrón de herencia en que creemos que se transmite la enfermedad. Como ya hemos dicho antes, desconocemos la herencia del síndrome de Opitz C, así que será necesario realizar tres tipos de filtrado distintos: autosómico dominante, autosómico recesivo e incluso recesivo ligado al X en el caso de los varones. De ahí la importancia de incluir a los padres en el proyecto y analizarlos también mediante secuenciación masiva.

Todos estos pasos de filtrados son llevados a cabo bioinformáticamente mediante el uso de algoritmos específicos adaptados a las necesidades de cada proyecto. En particular, nuestro grupo cuenta con la plataforma de Bioinformática de las enfermedades Raras (BIER), en Valencia.

Tras estos filtrado obtenemos un conjunto de cerca de mil posibles cambios que deben ser filtrados de forma más pormenorizada y priorizados [15]. Tras esta selección, los cambios deben ser validados.

Cada uno de estos posibles cambios será analizado en detalle mediante secuenciación tradicional. Cerca del 90% de ellos son falsos positivos (no existía tal cambio) o con falsa herencia (el patrón de herencia no era el que se suponía). Así, poco a poco, se van seleccionando aquellos cambios que podrían ser responsables del desarrollo de la patología en cada paciente.

Y una vez validado un cambio, ¿será responsable del Síndrome?

Todas las personas tenemos nuestras particularidades. A nivel genético también. Se estima que cada persona lleva una nueva mutación, no heredada de sus padres [16], conocidas como mutaciones de novo, pero la mayoría de estos cambios son inocuos. Existen indicios que nos ayudan a deducir si un cambio es responsable de una enfermedad o no. La función del gen, la posición del cambio dentro del gen, el tipo de cambio… y sobretodo que varios pacientes presenten cambios en el mismo gen [11]. Pero en algunas ocasiones es necesario empelar técnicas directas para elucidar si los cambios encontrados son responsables o no de la enfermedad. Se conocen como ensayos funcionales y en ellos se evalúa la función del gen “sano” y mutado “in vitro” en modelos celulares e incluso, si es necesario, “in vivo” en modelos animales.

Por el contrario, si aparecen mutaciones en varios pacientes en un mismo gen, tal como ocurre en el caso de las mutaciones de ASXL1 en el Síndrome de Bohring-Opitz, podemos tener una base razonable para determinar que el gen es el responsable de esta enfermedad (de ahí la necesidad de secuenciar cuantos más pacientes, mejor).

 

Referencias:

1.      Opitz J. M., et al., The C syndrome of multiple congenital anomalies. Birth Defects Orig. Art. Ser., 1969. 2: p. 161-166.

2.      Travan, L., et al., Opitz trigonocephaly syndrome presenting with sudden unexplained death in the operating room: a case report. J Med Case Rep, 2011. 5: p. 222.

3.      Lalatta, F., et al., «C» trigonocephaly syndrome: clinical variability and possibility of surgical treatment. Am J Med Genet, 1990. 37(4): p. 451-6.

4.      Antley, R.M., et al., Further delineation of the C (trigonocephaly) syndrome. Am J Med Genet, 1981. 9(2): p. 147-63.

5.      Sargent, C., et al., Trigonocephaly and the Opitz C syndrome. J Med Genet, 1985. 22(1): p. 39-45.

6.      Opitz, J.M., et al., Mortality and pathological findings in C (Opitz trigonocephaly) syndrome. Fetal Pediatr Pathol, 2006. 25(4): p. 211-31.

7.      Kaname, T., et al., Mutations in CD96, a member of the immunoglobulin superfamily, cause a form of the C (Opitz trigonocephaly) syndrome. Am J Hum Genet, 2007. 81(4): p. 835-41.

8.      Hoischen, A., et al., De novo nonsense mutations in ASXL1 cause Bohring-Opitz syndrome. Nat Genet, 2011. 43(8): p. 729-31.

9.      Darlow, J.M., et al., On the origins of renal cell carcinoma, vesicoureteric reflux and C (Opitz trigonocephaly) syndrome: A complex puzzle revealed by the sequencing of an inherited t(2;3) translocation. European Journal of Human Genetics, 2013. 21(Suppl. 2. (Abstract)): p. 145.

10.     Bainbridge, M.N., et al., De novo truncating mutations in ASXL3 are associated with a novel clinical phenotype with similarities to Bohring-Opitz syndrome. Genome Med, 2013. 5(2): p. 11.

11.     Brunham, L.R. and M.R. Hayden, Hunting human disease genes: lessons from the past, challenges for the future. Hum Genet, 2013. 132(6): p. 603-17.

12.     Bamshad, M.J., et al., Exome sequencing as a tool for Mendelian disease gene discovery. Nat Rev Genet, 2011. 12(11): p. 745-55.

13.     Mestan, K.K., et al., Genomic sequencing in clinical trials. J Transl Med, 2011. 9: p. 222.

14.     DePristo, M.A., et al., A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat Genet, 2011. 43(5): p. 491-8.

15.     Gilissen, C., et al., Disease gene identification strategies for exome sequencing. Eur J Hum Genet, 2012. 20(5): p. 490-7.

16.     Lynch, M., Rate, molecular spectrum, and consequences of human mutation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(3): p. 961-8.

 

Este artículo ha sido escrito por Roser Urreizti Frexedas como colaboración con Raras pero no invisibles. Podéis seguirlos en precipita